滴（dī）眼給藥毒性試驗的目的

滴眼給藥毒（dú）性試驗（yàn）是重複給藥一般毒（dú）性試驗，主要用於研發滴眼藥物（wù）。歐盟發布的《醫療用品非臨床局部耐受性試驗指導原則》（CPMP/SWP, 2001）明確規定了單次給藥和重（chóng）複給藥眼部耐受性試驗的相關事（shì）宜。美國食品藥（yào）品監督管理局發布（bù）的《藥品以及可替（tì）代性給藥藥品（pǐn）非臨床安（ān）全性評價指導原則草案》（FDA/CDER, 2008）則明確要求在滴眼（yǎn）給藥時應開展係統藥代（dài）動力學（PK）和眼科（kē）檢查（chá）（包括（kuò）裂隙燈顯微鏡檢（jiǎn）查、眼底檢查、眼壓測量及組織（zhī）病理學檢查）。然而，這兩（liǎng）份指導原則中的相關規定均較簡要，缺乏滴眼給藥毒性試驗詳細設計的具體內容。目前，尚無（wú）滴眼給藥（yào）毒性試驗的確切定義（yì）。日本（衛生福利部，1999）依據ICH M3指導原則（ICH, 2009）和ICH S4指（zhǐ）導原則開展滴眼給藥毒性試驗。這些原則（zé）通常適用於（yú）係統給藥的藥物。

有人常常將滴眼給藥毒性試驗與眼刺激試（shì）驗混為一談。實際上，滴眼毒性預試驗（yàn）、一周或兩周的重複給藥滴（dī）眼毒性試驗的方（fāng）案與眼刺激試驗的方案有相似之處（OECD, 2012）。

目前，眼刺激（jī）試驗通常使用兔子進行，以評估化學物質在粘（zhān）膜給藥或人體（tǐ）偶然接觸時的（de）安全（quán）性（OECD, 2012）。眼刺激試驗的主（zhǔ）要（yào）目的是檢測（cè）眼表的刺激或腐蝕反應（yīng）。

相比之下（xià），滴眼給藥毒性試驗的主要目的是（shì）評估眼科藥物的一般毒性。因此，滴眼給藥毒性試驗的檢查（chá）項目包括組織病理學檢查、眼部附（fù）屬（shǔ）器以及全身髒器的評價。這兩種試驗的差異見表（biǎo）1。

表1 滴眼給藥毒性試驗和眼刺激試驗的差（chà）異

滴眼給藥毒性試驗的設計

01、動物物種（zhǒng）

根據ICH M3指（zhǐ）導原則，一般毒性試驗（yàn）需選（xuǎn）擇兩（liǎng）種動物（ICH, 2009）。通常（cháng）情況下，會從齧齒類動物（wù）（如兔或小鼠（shǔ））和非齧齒類動物（犬或猴）中各選一種。然而，在過去十年間（2005~2016），經日本衛生（shēng）勞動（dòng）福（fú）利部（MHLW）批準，約九成的（de）滴（dī）眼液在研發過程（chéng）中，將兔作為開（kāi）展（zhǎn）滴眼（yǎn）給藥（yào）毒性試驗的首選實驗物種，其次常用的實驗（yàn）物種是（shì）猴（幾乎全部是食蟹猴），再然後是犬（見表2）。因此，滴眼給藥毒性試驗通常選擇兩種非齧齒（chǐ）類動（dòng）物。不過，動物物種的選擇是根（gēn）據具體情況而定的。因此，在評估（gū）某些藥（yào）物時，可能僅使用一個物種（zhǒng）（比如兔或食蟹猴）。

表2 2005~2016日本滴眼液滴眼給藥毒性試驗的獲批的動物物（wù）種（zhǒng） 

注：信息來源於日本（běn）醫藥（yào）和醫療器（qì）械局（jú）（PMDA）主頁

近來發表的多篇文章從眼部安全性評估的角（jiǎo）度出（chū）發，討論了（le）各個實驗物種的特點，並對不同實驗物種作了比較。各物種的特點如下。

兔

兔的眼球（qiú）重量約為（wéi）人眼的一半，眨眼頻率（每6分（fèn）鍾一次）明（míng）顯低（dī）於人（rén）類的眨眼頻率（每5秒（miǎo）鍾一次）。此外，兔的角膜（mó）比人類的角膜薄。基於這些特點，並考慮到影響藥物角膜滲透（tòu）能力的因素，有研究者預計，在滴入滴眼液後，兔眼的藥物暴露（lù）水平相對（duì）較高。McDonald和Shadduck（1977）認為兔相較於其他實驗動物對眼刺激物更（gèng）為敏（mǐn）感。使用兔進行試驗的其（qí）他原因（yīn）還包括較低（dī）的（de）動物成本以及（jí）基（jī）於大量供試品積累的曆史數據。

在進（jìn）行滴眼（yǎn）給藥毒性試驗時，特別需注意選擇色素兔還是白化兔。由於供試品能夠（gòu）與色素兔體內的色素結合，因此在毒性評估時，色素兔更具優勢。關於色（sè）素兔，荷蘭帶兔比新西蘭大（dà）白兔和新西蘭紅兔（F1代兔）更常用於滴（dī）眼給藥毒性試驗。Durairaj等人（2012）報（bào）告稱，人、食蟹猴、犬、豬、F1代兔和荷蘭帶兔的眼部黑色素含量存在差異，而且不（bú）同物種之間眼睛各部分的黑色素含量也不同。另外，值得一提的是，荷蘭帶兔的眼球比新西蘭大白兔或日本白兔的（de）小。

猴（hóu）

盡管食蟹猴的眼（yǎn）球重量僅約為人（rén）眼（yǎn）的一半，但（dàn）其解剖特征與人類相似。例如，食蟹猴的角膜和晶狀體相對（duì）較（jiào）小，眼底有黃斑。Shibuya等人（2015）建議將（jiāng）食蟹猴用作實驗動物，因為它們（men）的眼睛有助於詳細評估藥物誘導的黃斑病變毒性。食蟹猴的眨（zhǎ）眼頻率與（yǔ）人類相似。與人類一樣，食蟹猴既（jì）沒有瞬膜，也沒有哈氏腺，而兔（tù）、犬和豬則都有瞬膜和（hé）哈氏腺。食蟹猴和犬一樣，也用於（yú）係統毒性試驗。利用相關物種可以獲得毒（dú）理學數據，彌合局部給藥和係統給藥（yào）在同一物種中產生的結果差（chà）異。與人類相比，食蟹猴的眼組織黑色素含量相對較高。在猴（hóu）類中，視神經退化常見於恒河猴和食蟹猴，且被認為是自發性先天視神經病變。

犬和豬

針對特定目的飼養的比格犬的眼球重（chóng）量約為5.5克，約為人眼（yǎn）重量的0.8倍，而豬的眼球大小接近人眼。從眼球的絕對尺寸（cùn）來看，犬和（hé）豬在藥物局部效應評估方麵具有優勢，因為眼組織（zhī）的（de）厚度和長度是決定局部給藥藥物滲透性和分（fèn）布的重要因素。犬和（hé）豬的眼部解剖特（tè）征（zhēng）相似，例如，與靈長類（lèi）動（dòng）物相比，它們的晶狀體在眼球中占據的體積相對較大。另一方（fāng）麵，犬的（de）脈絡膜上（shàng）有毯氈層，而豬、兔（tù）或食蟹猴（hóu）則沒有。目前，犬和豬不常用於滴眼（yǎn）給藥毒性試驗，尤其是豬。然而，這類動物在滴眼給藥毒性試驗中仍有其獨特的優勢，理由如下：1. 基於上（shàng）述解剖和生（shēng）理（lǐ）特點，模（mó）仿人體藥物分布的可能性較高。2. 與兔和食蟹猴相（xiàng）比，由於犬和豬的（de）體型相對較大，通過係統給藥出現的藥物反應更少。

02、性別

根據一般毒性試（shì）驗指導（dǎo）原則（衛（wèi）生福利部，1999），滴眼給藥毒性試驗應（yīng）在兩種性別的動（dòng）物上進行。人類（lèi）、恒河（hé）猴和兔（tù）的眼軸長度（dù）存在性別差異（yì），但眼球尺寸的性別差異卻極其微小。Wagner等人（2008）研究了健康人（rén）眼（yǎn）和患病人眼的（de）性別差異，認為性激素影響了不同性別在患病狀態下的淚腺係統、眼瞼和眨眼頻率、以及角膜的解剖和特征。一般而言，幹眼流行病學研究（jiū）表明女性幹（gàn）眼發病率比男性（xìng）高。然而（ér），實驗動（dòng）物的眼睛是否存在顯著的性別差異尚（shàng）不明確。是否在滴（dī）眼給藥毒性試驗中使用兩種性別，尤其（qí）僅進（jìn）行眼毒性評估的試驗，仍有待進一步討論。

03、給藥

劑量和濃度

根據ICH M3指導原則（ICH，2009），一般毒性試驗的高劑量水平設定為最大耐受量（MTD）、最大給藥量（liàng）（MFD）或人體暴露量的（de）50倍。這一設定原則同樣適用於滴眼給藥毒性試驗。在某些情況下，高（gāo）劑量水平可以基（jī）於局部（bù）耐受性預試驗的（de）結果（guǒ）來（lái）確定。然而，在大多（duō）數情況下，滴眼給（gěi）藥毒性試驗的高劑量水平是根據（jù）MFD設定的，主要是（shì）由於製劑製（zhì）備的（de）某些（xiē）內在因素。

供試品的角（jiǎo）膜滲透性主要取決於（yú）製劑的特性。為了獲得有意義的風險評估結果，權威性滴眼給藥毒性試驗（例如首次人體試驗之前開展的GLP試驗）所用的供試製劑應與臨床試（shì）驗所用（yòng）的製劑一致或相（xiàng）近。供試品的濃度主要是根據其在製劑中的溶解度來定義的。至於製劑的調整，其他特性（如滲透壓、pH值和賦形劑）也十分（fèn）重要。滴眼液（yè）製（zhì）劑的酸堿度應在可接受的生（shēng）理（lǐ）範圍內。選擇防腐劑（jì）時，需避免（miǎn）其濃度達到引起毒性反應的水平。例如，有研究者發（fā）現，眼（yǎn）科製劑中常用的防腐劑苯紮氯銨在局部給藥時會誘發角膜變化。因此，眼科製劑中防腐劑的濃度是有限製的。因此，在大多（duō）數情況下（xià），滴眼（yǎn）給藥毒性試（shì）驗所設的最高劑量水平是基於受（shòu）試製劑的最大給藥量，而非供試品本身的特性來決（jué）定的。

滴眼體積

兔子的眼瞼較為鬆弛，結（jié）膜囊較大，因此能容納較大的滴眼液（yè）體積。根據OECD眼刺激（jī）試驗指導（dǎo）原則，兔子的滴眼體積為0.1 mL（OECD, 2012）。該（gāi）體積約為臨床（chuáng）標準滴眼液用藥體積（約0.04 mL）的兩倍。從（cóng）經驗（yàn）來看，不同物種的最大滴眼體積並（bìng）不相同。例如，比（bǐ）格犬和（hé）兔子的最大可行體積相似，而食蟹猴的最大可行體積則是比格犬和兔子的兩倍多。

需注意（yì）的是，眼部暴露量並不會隨著滴眼體積的增加而成比例增加，因為部分多餘的液體會通過鼻淚管流失（shī）。Lambert等（1993）假定在眼刺（cì）激試驗中，如果滴眼體積為0.01 mL（建議供試體積的十分之一），藥物與人（rén）眼刺激感受的相關性更（gèng）佳。因此，滴眼給藥毒性試驗（yàn）的滴眼體積可能需進一步討論。增（zēng）加滴眼體積並不能有效（xiào）提高眼部暴露量（liàng），反而（ér）可能導致（zhì）係統暴露量（liàng）增加，甚至引發意料之外的係統毒性反（fǎn）應。

單眼/雙眼給藥

供試品（pǐn）是單眼給藥還是雙眼給藥需慎重（chóng）考慮。從（cóng）動物福利的角度（dù）出發，若無特殊原因，應將供試品滴入單側（cè）眼睛。如一隻眼給予供試品（pǐn），另一隻眼則不給藥（即不接觸供試品），或給予對（duì）照品（例如溶媒製劑）作為對照。然而，嚴格來說，對照眼由於係統循環的影響，可能也會接觸到供試品。因此，在評估對照（zhào）眼的結果時，應該考慮到（dào）這一潛在的接觸因素。

給藥頻率

在標準的口服或靜（jìng）脈給藥一般毒性試驗（yàn）中，通常每天給藥一次；而（ér）在滴眼給藥毒性試驗中，通常一天給藥多次（cì）。非臨床試驗的滴眼頻率通常高於臨（lín）床試驗的給藥頻率。例如，非臨床試驗中可能每天滴眼4次（cì），而臨床試驗中則每天滴眼2次。滴眼給藥毒性試（shì）驗設定較高的給藥頻率，旨在獲得（dé）更（gèng）高的重複暴露量，特別是（shì）在供試品的生化特征導致最大（dà）藥（yào）物濃（nóng）度難以增加時更為重要。Chrai等人（1974）報（bào）告稱（chēng），如果兩次滴眼間（jiān）隔5分鍾，就能有效地增加兔的眼部暴露量。許多（duō）滴眼給藥毒性試驗（yàn）的給（gěi）藥頻率是臨床給藥頻率的1.5到2倍。然而，給藥過於頻繁（fán）雖可提高暴露水平，但（dàn）也增加操作的次數，從而增加動物保定的頻率，這可（kě）能導致動物應激，進而（ér）引發倫理問題。因此，在設計滴（dī）眼給藥毒性試驗時，需在提高（gāo）暴露水平和減少動物應激之間找到平衡點，以確保試驗的科學性（xìng）和倫理性。

04、眼（yǎn）及附屬組織檢查

常規/標準眼科學檢查

滴眼給（gěi）藥毒性試驗目前尚無統一的眼部和係統檢（jiǎn）查項目。OITSs的眼科學（xué）檢查是基於係統藥物一般毒性（xìng）評估指導原（yuán）則進行的，涵蓋了（le）眼前節、眼內介質和眼底等所有組織的檢查（ICH, 1999）。然（rán）而，由於滴眼（yǎn）給藥直接作用於眼（yǎn）部，滴眼給（gěi）藥毒性試驗的眼科學檢查更加詳細，涵蓋的檢查項目也更多。Weir和Wilson（2013）列出了非臨床眼毒性試驗的標準眼部安全性終點（diǎn），這些終點具（jù）有重要的借鑒意義。檢查項目包（bāo）括：大體觀察、裂隙燈生物（wù）顯微鏡檢查、眼底檢眼鏡檢查、眼壓測（cè）量、視網膜（mó）電圖和組（zǔ）織病理學。

基於相關指導原則和知識，表3總結了（le）滴眼給藥毒性試驗的常（cháng）規及可選（xuǎn）眼科檢查項目。由於眼前節的（de）供試（shì）品濃度較高，因（yīn）此（cǐ）對眼前節進行觀（guān）察和檢查尤為重要。除標準的大體觀察外，采（cǎi）用評分方法進行（háng）詳細觀察對於評估眼毒性的嚴重程度（dù）非（fēi）常關鍵。例如，Draize評分（fèn）法用於角膜、虹膜和結膜的大（dà）體觀察。McDonald Schadduck評（píng）分和Hackett-McDonald評分常應用於滴眼給藥毒性試（shì）驗（yàn）中，二者對（duì）裂（liè）隙燈顯微鏡檢查結果進行（háng）評分（fèn）。特別是，Hackett-McDonald評分能對眼睛進行全麵評估，包括對晶體和瞳孔光反射的評估。

表3 滴眼給藥毒性試驗（yàn）的常（cháng）規或可選眼科學檢查

常規檢查包括利用檢眼鏡對玻璃體和眼底進行觀察。使用直（zhí）接（jiē）檢眼鏡和間接檢眼鏡可詳細檢查眼底。本原則建議，除拍照外，還應（yīng）簡（jiǎn）述檢查結果並記錄，並將這些記錄與（yǔ）相應（yīng）的詳細記錄一（yī）同保存。

眼壓是（shì）衡量（liàng）前（qián）房角功能變化的重要參數。FDA指導原則提到了使用眼（yǎn）壓計的方法（FDA/CDER，2008）。在非臨（lín）床毒性試驗中，常用扁平（píng）眼壓計（jì）、回彈式眼壓計或空氣式眼壓計來測量眼壓（yā）。在滴（dī）眼給藥毒性試驗中，使用眼壓計有（yǒu）幾點注意事項。首先，為（wéi）了獲得準確的眼（yǎn）壓（yā）值，有必要使動物適應眼壓計。在測量之前，如果動物沒有適應（yīng）眼壓（yā）計，通常（cháng）情況下測出的眼壓值會偏高，從而導致無法正確判斷藥效。其次，由於儀（yí）器會接觸角膜表麵，眼壓（yā）測量操作可能會在某種程度上損傷（shāng）角（jiǎo）膜上皮細胞。因此，應慎重決定（dìng）檢查（chá）的組別及檢查順（shùn）序，以避免眼部（bù）過度應激，並防止過度應激影響其他結（jié）果的解讀。

通（tōng）過全（quán）視（shì）野（yě）視網膜電圖（tú）檢查（ffERG）可（kě）檢測視網膜的功能變化。理想的做法是使用國際臨床視覺電生理協會（ISCEV）建議的方法，因為此方法可在進行（háng）全視野視網膜電圖（tú）檢查時識別視錐細胞和視杆細胞的變化。然而，此方法不適用（yòng）於在有限時間內對大量動物進行檢查的情況。ISCEV方法擬用於隨診檢查，可能（néng）僅適用（yòng）於ERG檢查發現（xiàn）異常的情（qíng）況。例如，Penha等（děng）人（2010）報（bào）告稱，角膜混濁或晶體混濁會影響光線到達（dá）視網膜，而麻醉（zuì）也會影響全視（shì）野視網膜（mó）電圖的檢查結果。

可選檢查

關於淚膜檢查，Schirmer試驗和酚（fēn）紅線試驗用於淚液體積的（de）定量分析。進行Schirmer試驗和（hé）酚紅線試驗時，分別使用無毒濾紙或棉線浸潤於pH指示劑酚（fēn）紅溶液中，然後（hòu）插入結膜囊內進行淚膜檢測（cè）。淚膜的其他臨床檢查包括淚膜破裂時間（jiān）。此前已有研究者報告了犬和兔的淚膜破裂時間，這些測試能夠揭示淚腺的功能狀態。此外，眨眼頻率也可以（yǐ）間接說明供試品是否對角（jiǎo）膜產生了刺激。

由於眼科成像技術的進步，現（xiàn）在（zài）能（néng）檢測出常規眼科學檢查難以察覺的（de）變（biàn）化。例如，角膜共（gòng）焦顯微鏡檢查能夠捕捉到角膜上皮的細微變化；角膜內皮顯（xiǎn）微鏡（jìng）檢查能夠觀察到角膜內皮（pí）的形態和（hé）密度變（biàn）化；光學相幹（gàn）斷層掃描（OCT）對於視（shì）網膜的觀察非常有力（lì）。這（zhè）些成像技術均可（kě）用於滴眼給藥毒性試（shì）驗（yàn）中的動物檢（jiǎn）查，能夠生成高分辨（biàn）率的圖像，滿足組織病理學檢（jiǎn）查的（de）要求。

滴眼給藥毒性試驗的其（qí）他常用眼前節檢查包括定量測量角膜（mó）厚度的測厚儀和定量測量前房（fáng）房水閃輝的激光房水閃光（guāng）細胞儀。如果眼後節的（de）視網膜出現局部異常，多（duō）焦視網膜電圖（mfERG）能夠捕捉到相應的電生理信號。利（lì）用眼底血管熒光造影能夠觀察到視網膜和脈絡膜的原有血（xuè）管及新生血管的滲透性。

Kontadakis等人（2014）指出（chū），淚膜中的細胞因（yīn）子和生長（zhǎng）因子作為生（shēng）物標記物，能預示眼表疾病。有研究（jiū）者報告稱，血（xuè）清細胞因（yīn）子是預示（shì）老年黃斑（bān）變性（xìng）的生物標記物。生物（wù）標記物能用於非侵入性方式觀察藥物誘導的眼（yǎn）毒性反應。然而，目前（qián）這樣的生物標記物數量仍然有限。反過來，上述的各種眼部成像（xiàng）技術可能可替代生物標（biāo）記物，用於觀察和研究人和動（dòng）物的眼毒性。

05、眼及附屬組織的病理學（xué）檢查

組織病理檢查是滴眼給藥毒性試驗的重要組成（chéng）部分。最近，多篇文獻綜（zōng）述一致強調（diào）了組織病理學檢查在藥物評估中的重要性。在滴眼給藥毒性試驗中，供試品的最大暴露量不僅出現在角膜（mó）上皮，還（hái）出現在結膜和排泄係統，包括鼻淚管的粘膜和鼻腔（qiāng）。因此，需要（yào）特別注意細致檢（jiǎn）查這（zhè）些組織。淚腺、哈（hā）氏腺（若有）、鼻腔和瞬膜（若有）也應進（jìn）行組織病理學檢查。為了準確地（dì）進行組織病理學評估分析，必須嚴格考量組織病理切片（piàn）的質量。如今已有多（duō）篇（piān）關（guān）於這一方麵的文章發表，詳細闡述了切片的（de）各（gè）種技術考量（liàng）。